（建议）制备死细菌.若需要死细菌作为对照，可将活细菌放入水浴锅中95℃加热5min，或58℃加热3h，具体操作根据样本类型自行选择，即可获得死细菌.死细菌的后续操作同活细菌。两份活细菌，一份不用PMA处理，一份用25μMPMA处理（处理不同类型或不同来源细菌的PMA浓度需查阅相关文献）！将PMA处理的样本室温置于摇床上，避光孵育10min，使染料与样本充分混匀。将样品曝光，可以使用蓝色或白色光源，照射时间需自行摸索！

　　 关于叠氮溴化丙锭，作为一家主营产品为PMA（叠氮溴化丙锭）, 20 mM/L in water的厂家，上海晅科生物科技有限公司在生物诊断试剂这个行业中都享负盛名，在业界中也有一定的地位。

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　　产品介绍PMA是一种高亲和性的DNA结合染料，该染料本身具有微弱的荧光，但与核酸结合后可以发出更为明亮的荧光.它尤其与双链DNA具有高亲和性。PMA不具有细胞膜渗透性，因此可选择性地修饰膜受损的死细胞的DNA!PMA修饰的DNA经蓝光（~464nm）光解后，PMA上的光反应性叠氮基转化为高反应性氮烯自由基，与DNA结合位点附近的任何烃部分反应形成稳定的共价氮碳键，从而导致永，久性DNA修饰（图1）!

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　　使用方法使用前注意事项PMA根据细胞膜通透性区分死菌和活菌。许多杀死细菌的方法，会导致细胞膜受损，因此适用于PMA检测!但有些方法，如紫外线照射，可能不会立即导致细胞膜破裂！因此，在选择PMA检测之前，需先进行文献检索和预实验确定是否适用于您选择的细菌类型和杀伤方法.PMA处理完细菌后需要进行光解，以使染料与死细胞DNA共价结合。光解操作可以使用蓝色或白色光源.一般来说，灯越亮，光解步骤的效率就越高！

　　注：DNA提取步骤参考所用试剂盒的说明书。PMA的部分作用机制是通过沉淀从样品中去除PMA结合的DNA；因此，在提取基因组DNA时，各组应使用相同体积的基因组DNA洗脱液，进行体积归一化处理（死菌和活菌提取基因组DNA量不一致，因此两者浓度相差明显）。吸取10μL菌液于液体LB培养基，在细菌培养箱中培养过夜或更长时间，使细菌培养至对数生长期（OD600≈0)；注：培养基类型及培养时间根据实验调整！取活细菌两份，每份400μL，置于干净离心管中。

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　　该修饰过程会使DNA不溶，并使其在随后的基因组DNA提取过程中与细胞碎片一起丢失，进而阻碍死细胞中目标DNA的PCR扩增!残留在溶液中未结合的PMA，在强光照射下与水分子反应分解成无交联活性的羟胺化合物，使羟胺不再能够共价结合DNA，从而不影响PCR扩增。这个特性使得PMA可以通过实时定量PCR（qPCR）的手段，检测多种样本类型包括：细菌、生物膜、酵母、真菌、病毒和真核细胞；与qPCR、NGS、Sanger测序和LAMP技术相结合，广泛应用在食品和水安全和环境测试中！

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