该修饰过程会使DNA不溶,并使其在随后的基因组DNA提取过程中与细胞碎片一起丢失,进而阻碍死细胞中目标DNA的PCR扩增!残留在溶液中未结合的PMA,在强光照射下与水分子反应分解成无交联活性的羟胺化合物,使羟胺不再能够共价结合DNA,从而不影响PCR扩增。这个特性使得PMA可以通过实时定量PCR(qPCR)的手段,检测多种样本类型包括:细菌、生物膜、酵母、真菌、病毒和真核细胞;与qPCR、NGS、Sanger测序和LAMP技术相结合,广泛应用在食品和水安全和环境测试中!
产品介绍PMA是一种高亲和性的DNA结合染料,该染料本身具有微弱的荧光,但与核酸结合后可以发出更为明亮的荧光!它尤其与双链DNA具有高亲和性。PMA不具有细胞膜渗透性,因此可选择性地修饰膜受损的死细胞的DNA.PMA修饰的DNA经蓝光(~464nm)光解后,PMA上的光反应性叠氮基转化为高反应性氮烯自由基,与DNA结合位点附近的任何烃部分反应形成稳定的共价氮碳键,从而导致永,久性DNA修饰(图1)!
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为了验证PMA在测试样本中的有效性,可对比同处理样本-/+PMA之间的Ct(dCt)变化。实验材料(自备)光源(用于PMA修饰DNA后的光解步骤)细菌基因组DNA提取试剂盒配套的qPCRMix试剂盒对应样本类型的有效qPCR引物实验步骤吸取10μL菌液于液体LB培养基,在细菌培养箱中培养过夜或更长时间,使细菌培养至对数生长期(OD600≈0);注:培养基类型及培养时间根据实验调整.取活细菌两份,每份400μL,置于干净离心管中!
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非LED灯(如卤素灯)可能会加热您的样本并对分析产生负面影响,照射时需要使用冰块对样品降温处理!样本可以在光解后冷冻保存!若在进行PMA处理光解之前冷冻样本可能会损坏细胞膜并产生假阴性结果!如需在检测之前冷冻样本,建议先进行预实验.PMA的部分作用机制是通过沉淀从样本中去除PMA共价修饰的DNA;因此,在提取基因组DNA时,需使用相同体积的基因组DNA洗脱液,进行体积归一化处理.阳性对照可以使用活细胞的基因组DNA.
将PMA处理的样本室温置于摇床上,避光孵育10min,使染料与样本充分混匀。将样品曝光,可以使用蓝色或白色光源,照射时间需自行摸索!例如,可用60W的蓝光灯,照射15min!注:①若使用卤素灯,我们建议将PMA处理的样本管放在距离光源20cm处的冰块上.冰块应放在透明托盘中,调整光源使其直接指向样品,光解5-15min;②若直接用环境中获取的细菌进行实验,由于环境样本的复杂性或浑浊度,需适当延长光解时间。
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