试剂和用于样品制作的材料应直接运送至该区,不得经过其他区域.试剂原材料须贮存在本区内,并在本区内制备成所需的贮存试剂.对与气流压力的控制,本区应对外界保持微正压!标本制备区该区域主要进行的操作为样本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定DNA的合成.本区的压力梯度要求为:相对于邻近区域为正压,以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染.另外,由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染,所以应避免在本区内不必要的走动!
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然后,科学家将DNA模板与PCR反应混合物中的引物和其他试剂一起加入PCR仪器中.PCR反应混合物通常包括缓冲液、聚合酶、核苷酸和其他化学物质,以帮助聚合酶扩增目标DNA序列.PCR仪器会在不同温度下进行多个循环,每个循环包括变性、退火和延伸步骤!这些循环将模板DNA扩增成数百万份复制,从而使DNA序列数量扩大!科学家可以使用各种技术来分析PCR扩增产物!这可能包括凝胶电泳或定量PCR等方法!凝胶电泳是一种通过在凝胶上分离DNA分子的大小和形状来确定PCR扩增产物的方法。
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PCR实验室各区域仪器设备配备通常如下:试剂准备区仪器设备主要应有加样器、冰箱、天平、低速离心机、混匀器、可移动紫外灯等!可使用超净工作台作为试剂配制操作台面!标本制备区仪器设备主要应有生物(为B2,可避免提取核酸在柜内反复循环,造成标本间交叉“污染”,出现假阳性结果。此外还应配备加样器、台式高速离心机(冷冻及常温)、台式低速离心机、恒温设备(水浴和/或干浴仪)、冰箱、混匀器和可移动紫外灯等.扩增区主要仪器就是核酸扩增热循环仪(PCR仪,实时荧光或普通的)!
为避免交叉污染,进入各个工作区域须严格遵循单一方向进行,即只能从试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增和扩增产物分析区!各实验区之间的试剂及样品传递应通过传递窗进行!实验室空调通风系统设计及压力控制PCR实验室并没有严格的净化等级要求,但是为避免各个实验区域间交叉污染的可能性,宜采用全送全排的气流组织形式。同时,要严格控制送、排风的比例以保证各实验区的压力要求. 试剂贮存和准备区该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备.
完备的实验室配套设施完备的实验室配套设施是保证实验工作的必要条件,应根据各个实验室实验内容的不同配备相应的设备和仪器,如超净工作台、离心机、加样器等! 疾控PCR实验室基本要求PCR实验室依据所使用的方法可分为试剂准备、标本制备、扩增、产物分析等三或四个区域。只是使用实时荧光PCR仪、HIV病毒载量测定仪的PCR实验室,有上述前面三个区域即可。各区域应完全独立分隔,不应有任何的空气直通!产物分析区或三个区域的一个区域(即扩增及产物分析区),空气流向应由室外向室内,可通过在室内设置通风橱、排风扇或其他排风系统达到空气流由室外向室内流动的要求!