示例应用程序使用20倍摩尔过量的四嗪-PEG5–NHS酯在BupH缓冲液（pH5）中标记五个山羊IgG样品（100µL，5mg/mL、4mg/mL、3mg/mL、2mg/mL和1mg/mL）！类似地，使用20倍摩尔过量的TCO–PEG4–NHS酯标记BupH缓冲液（pH5）中0mg/mL的0!1mLHRP（500µg）60分钟。在去除过量试剂并测定每种蛋白质浓度后，将过量3倍的HRP–TCO以5mg/mL、4mg/mL、3mg/mL、2mg/mL和1mg/mL的浓度添加到IgG–四嗪中!

　　这一重要特征经常被忽视，然而，缺乏选择性是通过不必要和非选择性的分子内相互作用进行自共轭（同源二聚体形成）的驱动力!最后，重要的是化学反应性官能团具有生物相容性！连接反应在与生物分子相容的温和水性缓冲条件下进行是至关重要的，而不需要对生物系统具有高毒性的催化试剂（例如Cu（I））!生物正交化学官能团必须在长期水储存期间保持高度反应性但稳定，同时对高浓度的其他生物官能团保持惰性!不幸的是，只有少数化学转化符合这些严格定义的条件：反应性、选择性和生物相容性.

clickchemistrytools生物素探针

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　　反应性显然是在高稀释条件下进行应用的先决条件，例如蛋白质-蛋白质偶联!蛋白质-蛋白质偶联通常被限制在低蛋白质浓度（例如!1mg/mL）。反应性可以由生物正交反应物对的二阶速率常数来定义.产物形成的二阶速率常数越高，在合理的时间尺度内，在接近中性的pH下，在低反应物浓度下，在不必使用大量过量的任一生物分子的情况下，偶联就越有效.生物正交反应物在10µM下的二阶速率常数（M–1s–1）与随时间变化的共轭产率百分比之间的关系如图5所示.

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　　COA提供了所使用的测试方法、结果和产品的纯度水平！货号名称CAS号1016TCO–NHSEster1192TCO–PNBEsterCAS1438415-89-4A137TCO–PEG4–NHSEsterCAS1621096-79-41398TCO–PEG4–TFPEster1088TCO–PEG4–Acid1355SulfoTCO–Maleimdie1021TCO–Amine,HClsaltCAS1609659-02-01188TCO–PEG3–Amine1356AFDye488TCO1358AFDye568TCO1089Cy5TCO1124TetrazineAcidCAS1380500-92-41125MethyltetrazineAcidCAS1380500-88-81073Methyltetrazine–PEG4–AcidCAS1802907-91-01128Methyltetrazine–NHSEsterCAS1644644-96-11127Tetrazine–NHSEster1193Methyltetrazine–Sulfo–NHSEster1191Tetrazine–Sulfo–NHSEster1069Methyltetrazine–PEG4–NHSEsterCAS1802907-92-11399Methyltetrazine–PEG4–STPEster1143Tetrazine–PEG5–NHSEsterCAS1682653-80-01068Methyltetrazine–PEG4–Maleimide1011MethyltetrazineAmine,HClsaltCAS1092689-33-21130toolTetrazineAmine,HClsaltCAS1092689-33-21012Methyltetrazine–PEG4–Amine,HClsaltCAS1802908-05-91013Methyltetrazine–PEG4–Alkyne1022MethyltetrazineDBCO1014Methyltetrazine–PEG4–Azide1361AFDye488Tetrazine1357AFDye555Tetrazine1364AFDye594Tetrazine1189Cy5Tetrazine1027Cy7Methyltetrazine1117DBCOAcidCAS1353016-70-2A101DBCO–C6–Acid1CAS425485-72-8A101PDBCO–PEG5–AcidCu–自由点击化学（SPAAC）•生物相容性反应发生在温和的水性缓冲条件下•不需要催化剂或辅助试剂•生物正交对（DBCO/叠氮化物）表现出长期水稳定性•市面上有多种叠氮化物和环辛烯（如DBCO）•动力学对于相对高浓度的应用（例如，蛋白质-小分子缀合、蛋白质-肽缀合）足够快逆需求Diels-Alder反应•极快的动力学（800M–1s–1）允许在60分钟或更短时间内以1mg/mL的速度进行有效的蛋白质-蛋白质结合•生物相容性反应发生在环境温度下温和的水性缓冲条件下•不需要有毒催化剂或辅助试剂•四嗪和TCO改性的生物聚合物在水性储存中保持活性（在4°C下储存数周）•四嗪类药物和TCO不易获得，但可在市场上买到!

　　因此，只有一小部分化学转化适用于在环境温度下在pH中性的水性环境中对高度官能化的生物分子（如蛋白质、核酸和糖）进行生物正交连接，同时仍保持生物功能.适合特定应用的特定连接策略的选择基于不同的因素！铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应（CuAAC）的使用*限于铜毒性不重要的应用（例如肽或寡修饰，或细胞裂解物标记）！在这方面，菌株促进的炔烃-叠氮化物环加成反应（SPAAC）更适合生物偶联，因为不需要催化剂或额外的试剂！