在低生物分子浓度（例如5µM）下，SPAAC由于适度的动力学（例如0!3至3M–1s–1）而不足，并且铜催化的炔烃-叠氮化物环加成点击反应可能会危及系统的生存能力，反式-环辛烯-四嗪（TCO–Tz）是选择的反应对。这种连接化学是基于反式环辛烯和四嗪反应对之间的逆需求Diels-Alder环加成反应，形成二氢哒嗪键（图4）！化学选择性TCO–Tz连接对具有任何其他生物正交连接对都无法比拟的超快动力学（800M–1s–1）.

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　　生物正交激活的组分仅相互特异性和自发地反应，形成所需的缀合物。这种生物正交连接策略如图1所示为了使化学反应性官能团适合生物偶联，三个基本特征是非常重要的：反应性、化学选择性和生物相容性!第*个反应性显然是在高稀释条件下进行应用的先决条件，例如蛋白质-蛋白质偶联!由于蛋白质的可用性有限和/或相关的成本因素，蛋白质-蛋白质偶联通常被限制在低蛋白质浓度（例如1mg/mL）！反应性可以由生物正交反应物对的二阶速率常数来定义!

　　因此，只有一小部分化学转化适用于在环境温度下在pH中性的水性环境中对高度官能化的生物分子（如蛋白质、核酸和糖）进行生物正交连接，同时仍保持生物功能。适合特定应用的特定连接策略的选择基于不同的因素！铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应（CuAAC）的使用*限于铜毒性不重要的应用（例如肽或寡修饰，或细胞裂解物标记）!在这方面，菌株促进的炔烃-叠氮化物环加成反应（SPAAC）更适合生物偶联，因为不需要催化剂或额外的试剂!

　　产物形成的二阶速率常数越高，在合理的时间尺度内，在接近中性的pH下，在低反应物浓度下，在不需要使用大量过量的情况下，偶联就越有效任何一种生物分子！生物正交反应物在10µM下的二阶速率常数（M–1s–1）与随时间变化的共轭产率百分比之间的关系如图2所示。反应物的另一个重要的生物偶联特征是它们具有化学选择性。也就是说，在其他生物官能团（例如氨基（-NH2）、羧基（-COOH）和/或硫醇（-SH））的丰富环境中，彼此之间具有选择性反应性!

　　在去除过量试剂并测定每种蛋白质浓度后，将过量3倍的HRP–TCO以5mg/mL、4mg/mL、3mg/mL、2mg/mL和1mg/mL。60分钟后，通过SDS–PAGE分析每个偶联反应的等分试样（1µL）！货号名称CAS号A133DBCO–NHSEsterCAS1353016-71-3A102DBCO–C6–NHSEsterCAS1384870-47-6A102PDBCO–PEG5–NHSEsterCAS1378531-80-61400SulfoDBCO–TFPEster1260DBCO–PEG5–TFPEsterA124DBCO–Sulfo–NHSEsterCAS1400191-52-71259DBCO–STPEster1230SulfoDBCO–Maleimide1023MethyltetrazineDBCOA105DBCO–PEG4–BiotinCAS1255942-07-4A116WSDBCO–BiotinCAS1363444-70-5A118DBCO–mPEG5kDaA119DBCO–mPEG10kDaA120DBCO–mPEG20kDaA121DBCO–mPEG30kDa1310AFDye405DBCO1274AFDye430DBCO1278AFDye488DBCO1282AFDye532DBCO1286AFDye546DBCO1290AFDye555DBCO1294AFDye568DBCO1298AFDye594DBCO1302AFDye647DBCOA127DBCOCarboxyrhodamine110A131DBCOTAMRAA140DBCOCy3A130DBCOCy51046DBCOCy51047DBCOCy71190MBTM488DBCO1174MBTM543DBCO1184MBTM594DBCOTA102Alkyne–PEG4–Acid1080PropargylAcidTA103Alkyne–PEG4–NHSEsterTA111Propargyl–NHSEster1162PCAlkyne–NHSEster产品：TCO四嗪配体的试剂DBCO试剂无铜点击化学点击化学叠氮化物/炔烃试剂含氟叠氮化物探针下一代叠氮化物探针代谢标记试剂可切割点击化学生物素探针无生物素/链霉亲和素富集试剂盒和培养基TCO四嗪配体TCO试剂四嗪选择指南四嗪试剂荧光四嗪DBCO试剂标记试剂和构建块生物素化试剂荧光试剂炔烃标记试剂和构建块生物素化试剂荧光试剂叠氮化物标记试剂和构建块生物素化试剂荧光试剂荧光叠氮化物探针34荧光吡啶叠氮化物三功能点击化学生物素探针可切割点击化学生物素探针DADPS生物素探针光可切割生物素探针Dde生物素探针双偶氮生物素探针单击化学辅助试剂代谢标记试剂富集培养基和试剂盒不可裂解的富集试剂盒可裂解的浓缩试剂盒和培养基点击功能化琼脂术语生物正交化学是指在生物系统中发现的其他丰富化学官能团存在的情况下，在不与天然生物化学过程相互作用或干扰的情况下发生的任何化学反应。

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