实验操作流程如下：诱导与转化：将制备好的分别带GST和His标签的质粒转化至BL21感受态细胞中A！质粒加入细菌B。冰上30minC!42℃水浴5s或1minD。向转化混合物中加入500µLLB，不加抗生素，160rpm37℃摇床振荡1hE.涂板隔夜培养；pGEX用A板，pET用K板F。挑选阳性克隆（引物根据自己做的质粒选择）G!将阳性克隆加入至3mLLB培养液，220rpm37℃过夜小摇H！取200µL菌液加入20mLLB培养液（50mL离心管内），1:1000分别加入氨苄西林（pGEX）及卡那霉素（pET-28a）220rpm37℃4-6小时I！

　　GST-Pulldown是在体外验证两种蛋白质结合的方法之一，其原理是目的蛋白与GST融合表达，蛋白固定在谷胱甘肽（GSH）亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支持物，起到“诱饵蛋白”的作用.目标蛋白溶液通过柱子，从中可以捕获相互作用的“捕获蛋白”（目标蛋白）！结合物洗脱后，通过蛋白质印迹(WB)分析证实了两种蛋白质之间的相互作用。“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”都可以通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录和翻译系统获得，这种方法简单易操作!

哈尔滨GST-pull down公司

　　50%GSTSepharose4Bslurry的准备（11）将原75%GlutathioneSepharose4Bslurry弹至均匀;（12）取677μL原液/管,3000rpm,离心5分钟,弃上清;（13）加500μLPBS,颠倒混匀,3000rpm,离心5分钟,弃上清,反复5次;（14）加500μLPBS,颠倒混匀,配成50%GlutathioneSepharose4B备用!100mMIPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：38gIPTG溶于100mlddH2O中，0!

　　▼背景说明蛋白互作在细胞生命活动中起着关键作用,在不同时空层面上参与多种细胞过程,因此研究蛋白互作对于理解分子调控网络至关重要。通常情况下,利用酵母双杂交系统筛选植物蛋白互作必须利用体外和体内系统进行验证.Pull-down就是验证植物蛋白互作的常用技术，被广泛用于体外验证蛋白间的直接互作！▼应用场景Pull-down技术,也叫蛋白质体外结合实验,是一种行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术！▼实验原理将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽标记的珠子上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液与之孵育,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,诱饵蛋白和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。

　　C。在磁珠中加入400µLElutionbuffer，室温震荡2分钟，磁性分离收集洗液!反复3次！D.将3次中收集到的液体用10K的超滤管进行浓缩，5000g，离心15分钟，加入500µLBC100缓冲液进行缓冲液置换，5000g，离心15分钟，收集到50-100µL浓缩蛋白！蛋白结合及检测：A。纯化蛋白结合：向GST及GST-DNMT3Lbeads中分别加入10µLHis-USP46纯化蛋白，4℃震荡孵育1小时，5000rpm离心30秒，两次，沉淀beads!

　　B！吸出上清！以1mLBC100缓冲液（含0！1%TritonX-100）清洗beads3次！C!加入1xloadingbuffer50µL，连同input样本，95℃金属浴5min.离心分离beads，取上清进行Westernblot检测！将表达GST融合蛋白（实验组）和GST（对照组）的质粒分别转入BL21菌株中!分别挑取阳性单克隆于3ml含有抗生素的LB液体培养基中，37度，200转，过夜培养。　　涉及的范围包括：农产品产地环境，灌溉水质，农业投入品合理使用准则;动植物检疫规程;良好农业操作规范;食品中农药、兽药、污染物、有害微生物等限量标准;食品添加剂及其使用标准;食品包装材料卫生标准;特殊膳食食品标准;食品标签标识标准;食品安全生产过程管理和控制标准;食品检测方法标准;涉及粮食、油料、水果蔬菜及制品、乳与乳制品、肉禽蛋及制品、水产品、饮料、酒、调味品、婴幼儿食品等可食用农产品和加工食品，基本涵盖了从食品生产、加工、流通到最终消费的各个环节。