密度梯度离心不仅可依据样品颗粒的重量及沉降系数进行分离,还可根据样品颗粒的密度、形状等特征进行分离!密度梯度离心在整个离心过程中只使用一种转速,中途无需变更实验参数,而差速离心则需要进行调整转速、重悬反复离心等操作!密度梯度离心适宜分离密度有一定差异的样品,而差速离心则适用于分离混合样品中各沉降系数差别较大的组分。密度梯度离心的优点是:分离效果好,可一次性获得较纯的样品颗粒;适应范围广,既可像差速离心法一样分离具有沉降系数差异的颗粒,又能分离有一定浮力密度差的颗粒;颗粒会悬浮在相应的位置上形成区带,而不会形成沉淀被挤压变形,故能zui大限度保持样品的生物活性;样品处理量大,且可同时处理多个样品;对温度变化及加减速引起的扰动不敏感!
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本法可分离各种细胞、病毒、染色体、脂蛋白、DNA和RNA等生物样品离心技术,是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离的zui常用的方法之一,也是生化实验室中常用的分离、纯化或澄清的方法。尤其是超速冷冻离心已经成为研究生物大分子实验室中的常用技术方法!差速离心是根据颗粒大小和密度不同造成沉降速度(即沉降系数)的差异,通过分级提高离心转速或高速与低速离心交替进行,使具有不同质量的颗粒样品(或大分子)从混合液中分批沉降至管底,从而实现分离目的。
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密度梯度离心法的缺点是:离心时间长、需制备密度梯度介质溶液、对操作者的技能要求较高!密度梯度离心法通常采用吊桶式的水平转子、区带转子及近垂直转子。离心前,离心管内先装入分离介质(如蔗糖、ganyou等),使形成连续的或不连续的密度梯度介质,然后加入样品进行离心,具体又可分为:速度区带离心前,离心管内先装入蔗糖、甘you、CsCl、Percoll等密度梯度介质,待分离样品铺在梯度液的顶部,离心管底部或梯度层中间,同梯度液一起离心,利用各颗粒在梯度液中沉降速度或漂浮速度的不同,使具有不同沉降速度的颗粒处于不同密度的梯度层内,达到彼此分离的目的。
该方法适用于混合样品中各沉降系数差别较大的组分之间的分离,更准确地说是沉降系数差别在1至几个数量级的混合样品的分离,差别越大,分离效果越好差速离心法一般采用固定角转子,通过较低速度的离心沉淀,zui重的颗粒将全部沉到管底。继续将上清液以更高的转速沉淀,即可得到次重的颗粒样品!逐步增加离心转速,即可分别得到不同重量的样品颗粒,以达到分离的目的!但以上只是理想状态,通常每步得到的沉淀并不均一,通常会混有较轻的颗粒.
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