阳性对照可以使用活细胞的基因组DNA.为了验证PMA在测试样本中的有效性，可对比同处理样本-/+PMA之间的Ct(dCt)变化！实验材料（自备）光源（用于PMA修饰DNA后的光解步骤）细菌基因组DNA提取试剂盒配套的qPCRMix试剂盒对应样本类型的有效qPCR引物实验步骤吸取10μL菌液于液体LB培养基，在细菌培养箱中培养过夜或更长时间，使细菌培养至对数生长期（OD600≈0)；注：培养基类型及培养时间根据实验调整！

　　该修饰过程会使DNA不溶，并使其在随后的基因组DNA提取过程中与细胞碎片一起丢失，进而阻碍死细胞中目标DNA的PCR扩增。残留在溶液中未结合的PMA，在强光照射下与水分子反应分解成无交联活性的羟胺化合物，使羟胺不再能够共价结合DNA，从而不影响PCR扩增。这个特性使得PMA可以通过实时定量PCR（qPCR）的手段，检测多种样本类型包括：细菌、生物膜、酵母、真菌、病毒和真核细胞；与qPCR、NGS、Sanger测序和LAMP技术相结合，广泛应用在食品和水安全和环境测试中.

　　建议稀释的几组基因组浓度在qPCR分析体系的范围内!以Ct值为纵坐标，细胞数为横坐标，制作标准曲线。计算实验样本的拷贝数：Ct=斜率*细胞数+y轴截距（y=mx+b）细菌数样本=（Ct–y轴截距）/斜率注：☆纯化过程中活细菌DNA未损失!示例：E！coli（uidA）图活/死大肠杆菌用25μMPMA孵育，然后光解.后提取gDNA，用uidA引物进行扩增。注意事项使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验.

　　产品介绍PMA是一种高亲和性的DNA结合染料，该染料本身具有微弱的荧光，但与核酸结合后可以发出更为明亮的荧光！它尤其与双链DNA具有高亲和性.PMA不具有细胞膜渗透性，因此可选择性地修饰膜受损的死细胞的DNA.PMA修饰的DNA经蓝光（~464nm）光解后，PMA上的光反应性叠氮基转化为高反应性氮烯自由基，与DNA结合位点附近的任何烃部分反应形成稳定的共价氮碳键，从而导致永，久性DNA修饰（图1）。

　　试剂盒组分中含有荧光染料，使用及保存过程中注意避光！为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作.DilinoleylDiI（细胞膜橙红色荧光探针）DiD（细胞膜红色荧光探针）DiR（细胞膜近红外荧光探针）CytoMBriteTM细胞膜红色荧光探针CellTrackerCM-DiI（细胞膜橙红色荧光探针）CellTrackerCM-DiI（细胞膜橙红色荧光探针）DiOPlus（细胞膜绿色荧光探针升级款）CytoMBriteTM细胞膜橙红色荧光探针Hoechst33258Hoechst33258染色液（即用型）Hoechst33342Hoechst33342染色液（即用型）DAPI（4,6-二脒基-2-苯，基吲哚二盐酸盐）DAPI染色液（即用型）PropidiumIodide（碘化丙锭，PI）EthidiumHomodimer-I（溴乙啡锭二聚体I，EthD-I）DRAQ5活细胞DNA染料DRAQ5活细胞DNA染料DRAQ5活细胞DNA染料DRAQ7死细胞DNA染料DRAQ7死细胞DNA染料DRAQ7死细胞DNA染料7-AADOxazoleyellow（恶唑黄）,1mMinDMSOCalceinAM（钙黄绿素AM）LuciferYellowCada，verine.

　　为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。死细菌的dCt取决于许多因素，包括：菌株系/细胞类型；细菌被杀死方式；PMA使用浓度；扩增序列长度！活细菌占比计算如果死、活细菌对照结果正常，可以进入样本中活细菌占比计算。计算样本的dCt值：转换dCt值为活细菌比例：计算活细菌的绝，对数量dCt样本=Ct(样本,PMA处理)-Ct(样本,PMA未处理)PMA抑制倍数=2（样本dCt）活细菌%=100/PMA抑制倍数如果想计算样本中活细菌的绝，对数量☆，需要用已知数量的目标菌的基因组DNA制作标准曲线.

　　建议开始PMAqPCR活细菌检测前，先验证引物及PCR程序是否合适。死、活细菌对照dCt计算qPCR结束后，使用仪器软件计算每个样本的Ct值！通过计算每个对照细菌的dCt的方式，判断PMA是否成功抑制了死细菌DNA的扩增，计算如下：dCt活=Ct(活,PMA处理)-Ct(活,PMA未处理)dCt死=Ct(死,PMA处理)-Ct(死,PMA未处理)活细菌的dCt期望值接近于0±1，这表明PMA不会影响活细胞DNA的扩增；死细菌的dCt期望值大于4（dCt为4表示减少了约16倍，即去除了94%的死细菌DNA；dCt为8表示减少了约250倍，即去除了96%的死细菌DNA）。

20mM/LPMA标准液品牌