为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作！死细菌的dCt取决于许多因素，包括：菌株系/细胞类型；细菌被杀死方式；PMA使用浓度；扩增序列长度!活细菌占比计算如果死、活细菌对照结果正常，可以进入样本中活细菌占比计算!计算样本的dCt值：转换dCt值为活细菌比例：计算活细菌的绝，对数量dCt样本=Ct(样本,PMA处理)-Ct(样本,PMA未处理)PMA抑制倍数=2（样本dCt）活细菌%=100/PMA抑制倍数如果想计算样本中活细菌的绝，对数量☆，需要用已知数量的目标菌的基因组DNA制作标准曲线.

　　图PMA修饰DNA后通过qPCR定量活菌和死菌的原理使用方法使用前注意事项PMA根据细胞膜通透性区分死菌和活菌！许多杀死细菌的方法，会导致细胞膜受损，因此适用于PMA检测！但有些方法，如紫外线照射，可能不会立即导致细胞膜破裂。因此，在选择PMA检测之前，需先进行文献检索和预实验确定是否适用于您选择的细菌类型和杀伤方法。PMA处理完细菌后需要进行光解，以使染料与死细胞DNA共价结合.光解操作可以使用蓝色或白色光源。

　　阳性对照可以使用活细胞的基因组DNA。为了验证PMA在测试样本中的有效性，可对比同处理样本-/+PMA之间的Ct(dCt)变化。实验材料（自备）光源（用于PMA修饰DNA后的光解步骤）细菌基因组DNA提取试剂盒配套的qPCRMix试剂盒对应样本类型的有效qPCR引物实验步骤吸取10μL菌液于液体LB培养基，在细菌培养箱中培养过夜或更长时间，使细菌培养至对数生长期（OD600≈0)；注：培养基类型及培养时间根据实验调整。

找20mM/LPMA标准液

　　YF555Click-iTEdU通用款细胞增殖检测试剂盒（橙红色荧光）YF555Click-iTEdU通用款细胞增殖检测试剂盒（橙红色荧光）YF555Click-iTEdU通用款细胞增殖检测试剂盒（橙红色荧光）YF555Click-iTEdU通用款细胞增殖检测试剂盒（橙红色荧光）YF594Click-iTEdU通用款细胞增殖检测试剂盒（红色荧光）YF594Click-iTEdU通用款细胞增殖检测试剂盒（红色荧光）YF594Click-iTEdU通用款细胞增殖检测试剂盒（红色荧光）YF594Click-iTEdU通用款细胞增殖检测试剂盒（红色荧光）YF647AClick-iTEdU通用款细胞增殖检测试剂盒（远红荧光）YF647AClick-iTEdU通用款细胞增殖检测试剂盒（远红荧光）YF647AClick-iTEdU通用款细胞增殖检测试剂盒（远红荧光）YF647AClick-iTEdU通用款细胞增殖检测试剂盒（远红荧光）EDU（5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷）EDU（5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷）EDU（5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷）CFDASE细胞增殖与示踪检测试剂盒CFDASE细胞增殖与示踪检测试剂盒DiO（细胞膜绿色荧光探针）DiA（细胞膜绿色荧光探针）DiI（细胞膜橙红色荧光探针）产品说明书PMA（叠氮溴化丙锭）,20mMinwater产品货号：XK4051产品规格：100μL产品参数外观：橙红色液体Ex(pH3)=464nm(beforephotolysis)Ex/Em(afterphotocrosslinkingtonucleicacid)=510/610nm分子式：C27H32Cl2N6分子量：515储存条件-20℃避光保存，有效期见外包装。

　　建议稀释的几组基因组浓度在qPCR分析体系的范围内!以Ct值为纵坐标，细胞数为横坐标，制作标准曲线.计算实验样本的拷贝数：Ct=斜率*细胞数+y轴截距（y=mx+b）细菌数样本=（Ct–y轴截距）/斜率注：☆纯化过程中活细菌DNA未损失!示例：E!coli（uidA）图活/死大肠杆菌用25μMPMA孵育，然后光解！后提取gDNA，用uidA引物进行扩增。注意事项使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验！

高品质20mM/LPMA标准液

　　注：①商用DNA提取试剂盒提取的DNA，qPCR模板以2μL作为起始优化体积；②模板体积不得超过最终反应体积的10%；③模板浓度：gDNA做模板时，通常1-10ng即可；④PCR引物的终浓度通常为0!4μM，可以得到较好的结果，反应性能较差时，可以在0。2-1μM范围内调整引物浓度。轻轻涡旋混匀反应混合液，转移固定体积至PCR管.测试程序（根据自备qPCRMix试剂盒程序进行程序设定）!数据分析使用活细菌和死细菌作为对照，分析计算样本中活细胞数！

　　一般来说，灯越亮，光解步骤的效率就越高!非LED灯（如卤素灯）可能会加热您的样本并对分析产生负面影响，照射时需要使用冰块对样品降温处理。样本可以在光解后冷冻保存！若在进行PMA处理光解之前冷冻样本可能会损坏细胞膜并产生假阴性结果.如需在检测之前冷冻样本，建议先进行预实验。PMA的部分作用机制是通过沉淀从样本中去除PMA共价修饰的DNA；因此，在提取基因组DNA时，需使用相同体积的基因组DNA洗脱液，进行体积归一化处理。