建议稀释的几组基因组浓度在qPCR分析体系的范围内！以Ct值为纵坐标，细胞数为横坐标，制作标准曲线!计算实验样本的拷贝数：Ct=斜率*细胞数+y轴截距（y=mx+b）细菌数样本=（Ct–y轴截距）/斜率注：☆纯化过程中活细菌DNA未损失。示例：E!coli（uidA）图活/死大肠杆菌用25μMPMA孵育，然后光解！后提取gDNA，用uidA引物进行扩增!注意事项使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验！

　　阳性对照可以使用活细胞的基因组DNA！为了验证PMA在测试样本中的有效性，可对比同处理样本-/+PMA之间的Ct(dCt)变化！实验材料（自备）光源（用于PMA修饰DNA后的光解步骤）细菌基因组DNA提取试剂盒配套的qPCRMix试剂盒对应样本类型的有效qPCR引物实验步骤吸取10μL菌液于液体LB培养基，在细菌培养箱中培养过夜或更长时间，使细菌培养至对数生长期（OD600≈0)；注：培养基类型及培养时间根据实验调整。

　　为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作.死细菌的dCt取决于许多因素，包括：菌株系/细胞类型；细菌被杀死方式；PMA使用浓度；扩增序列长度!活细菌占比计算如果死、活细菌对照结果正常，可以进入样本中活细菌占比计算!计算样本的dCt值：转换dCt值为活细菌比例：计算活细菌的绝，对数量dCt样本=Ct(样本,PMA处理)-Ct(样本,PMA未处理)PMA抑制倍数=2（样本dCt）活细菌%=100/PMA抑制倍数如果想计算样本中活细菌的绝，对数量☆，需要用已知数量的目标菌的基因组DNA制作标准曲线!

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　　将样品曝光，可以使用蓝色或白色光源，照射时间需自行摸索.例如，可用60W的蓝光灯，照射15min.注：①若使用卤素灯，我们建议将PMA处理的样本管放在距离光源20cm处的冰块上.冰块应放在透明托盘中，调整光源使其直接指向样品，光解5-15min；②若直接用环境中获取的细菌进行实验，由于环境样本的复杂性或浑浊度，需适当延长光解时间!注意事项使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。试剂盒组分中含有荧光染料，使用及保存过程中注意避光！

　　该修饰过程会使DNA不溶，并使其在随后的基因组DNA提取过程中与细胞碎片一起丢失，进而阻碍死细胞中目标DNA的PCR扩增.残留在溶液中未结合的PMA，在强光照射下与水分子反应分解成无交联活性的羟胺化合物，使羟胺不再能够共价结合DNA，从而不影响PCR扩增。这个特性使得PMA可以通过实时定量PCR（qPCR）的手段，检测多种样本类型包括：细菌、生物膜、酵母、真菌、病毒和真核细胞；与qPCR、NGS、Sanger测序和LAMP技术相结合，广泛应用在食品和水安全和环境测试中。

　　图PMA修饰DNA后通过qPCR定量活菌和死菌的原理使用方法使用前注意事项PMA根据细胞膜通透性区分死菌和活菌.许多杀死细菌的方法，会导致细胞膜受损，因此适用于PMA检测.但有些方法，如紫外线照射，可能不会立即导致细胞膜破裂！因此，在选择PMA检测之前，需先进行文献检索和预实验确定是否适用于您选择的细菌类型和杀伤方法!PMA处理完细菌后需要进行光解，以使染料与死细胞DNA共价结合.光解操作可以使用蓝色或白色光源.