产品介绍PMA是一种高亲和性的DNA结合染料，该染料本身具有微弱的荧光，但与核酸结合后可以发出更为明亮的荧光。它尤其与双链DNA具有高亲和性。PMA不具有细胞膜渗透性，因此可选择性地修饰膜受损的死细胞的DNA!PMA修饰的DNA经蓝光（~464nm）光解后，PMA上的光反应性叠氮基转化为高反应性氮烯自由基，与DNA结合位点附近的任何烃部分反应形成稳定的共价氮碳键，从而导致永，久性DNA修饰（图1）.

　　建议稀释的几组基因组浓度在qPCR分析体系的范围内!以Ct值为纵坐标，细胞数为横坐标，制作标准曲线。计算实验样本的拷贝数：Ct=斜率*细胞数+y轴截距（y=mx+b）细菌数样本=（Ct–y轴截距）/斜率注：☆纯化过程中活细菌DNA未损失!示例：E!coli（uidA）图活/死大肠杆菌用25μMPMA孵育，然后光解.后提取gDNA，用uidA引物进行扩增.注意事项使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验！

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　　试剂盒组分中含有荧光染料，使用及保存过程中注意避光!为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作!DilinoleylDiI（细胞膜橙红色荧光探针）DiD（细胞膜红色荧光探针）DiR（细胞膜近红外荧光探针）CytoMBriteTM细胞膜红色荧光探针CellTrackerCM-DiI（细胞膜橙红色荧光探针）CellTrackerCM-DiI（细胞膜橙红色荧光探针）DiOPlus（细胞膜绿色荧光探针升级款）CytoMBriteTM细胞膜橙红色荧光探针Hoechst33258Hoechst33258染色液（即用型）Hoechst33342Hoechst33342染色液（即用型）DAPI（4,6-二脒基-2-苯，基吲哚二盐酸盐）DAPI染色液（即用型）PropidiumIodide（碘化丙锭，PI）EthidiumHomodimer-I（溴乙啡锭二聚体I，EthD-I）DRAQ5活细胞DNA染料DRAQ5活细胞DNA染料DRAQ5活细胞DNA染料DRAQ7死细胞DNA染料DRAQ7死细胞DNA染料DRAQ7死细胞DNA染料7-AADOxazoleyellow（恶唑黄）,1mMinDMSOCalceinAM（钙黄绿素AM）LuciferYellowCada，verine.

　　建议开始PMAqPCR活细菌检测前，先验证引物及PCR程序是否合适。死、活细菌对照dCt计算qPCR结束后，使用仪器软件计算每个样本的Ct值！通过计算每个对照细菌的dCt的方式，判断PMA是否成功抑制了死细菌DNA的扩增，计算如下：dCt活=Ct(活,PMA处理)-Ct(活,PMA未处理)dCt死=Ct(死,PMA处理)-Ct(死,PMA未处理)活细菌的dCt期望值接近于0±1，这表明PMA不会影响活细胞DNA的扩增；死细菌的dCt期望值大于4（dCt为4表示减少了约16倍，即去除了94%的死细菌DNA；dCt为8表示减少了约250倍，即去除了96%的死细菌DNA）！

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　　取活细菌两份，每份400μL，置于干净离心管中.（建议）制备死细菌!若需要死细菌作为对照，可将活细菌放入水浴锅中95℃加热5min，或58℃加热3h，具体操作根据样本类型自行选择，即可获得死细菌.死细菌的后续操作同活细菌！两份活细菌，一份不用PMA处理，一份用25μMPMA处理（处理不同类型或不同来源细菌的PMA浓度需查阅相关文献）！将PMA处理的样本室温置于摇床上，避光孵育10min，使染料与样本充分混匀。

　　将样品曝光，可以使用蓝色或白色光源，照射时间需自行摸索!例如，可用60W的蓝光灯，照射15min。注：①若使用卤素灯，我们建议将PMA处理的样本管放在距离光源20cm处的冰块上。冰块应放在透明托盘中，调整光源使其直接指向样品，光解5-15min；②若直接用环境中获取的细菌进行实验，由于环境样本的复杂性或浑浊度，需适当延长光解时间。注意事项使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。试剂盒组分中含有荧光染料，使用及保存过程中注意避光.

　　图PMA修饰DNA后通过qPCR定量活菌和死菌的原理使用方法使用前注意事项PMA根据细胞膜通透性区分死菌和活菌!许多杀死细菌的方法，会导致细胞膜受损，因此适用于PMA检测!但有些方法，如紫外线照射，可能不会立即导致细胞膜破裂!因此，在选择PMA检测之前，需先进行文献检索和预实验确定是否适用于您选择的细菌类型和杀伤方法！PMA处理完细菌后需要进行光解，以使染料与死细胞DNA共价结合!光解操作可以使用蓝色或白色光源.